【PCO论坛】西湖主要优势种拜氏铗蠓种群动态与系统发育研究【灭白蚁公司】

蠓是种“裸眼静止不动的姜片虫”，由于体形细微（1-3 mm)，时常在白天或白天惊慌失措地反击家畜和鸟类（虞以新，2006a；Borkent和Dominiak，2020)，透过雌蠓持续传染臭虫可散播许多病菌、耳稃和toxic等病菌，如：病毒感染人的奥普切罗热和toxic病、哺乳类间的蓝舌病和丙型肝炎、卡利鸟类间的西非马瘟等（Mellor等，2000；Mullen & Murphree 2019)。过去近两年，臭虫库蠓散播的蓝舌病菌和赖埃特尔病菌，使欧洲的种植业遭受了巨大的损失（Koenraadt等，2014)。

除蠛蠓属外，铗蠓总科均为非臭虫蠓类，是蠓虫类中第二大种属，也是温带和温带沿海地区许多植物重要的授粉鼠类（de Meillon & Wirth，1991)。数目极其巨大，是绝大多数沿海地区主要就竞争优势种，而且多半喜欢夕阳西下活动。

西溪蠓类也以铗蠓和毛蠓属为主，尽管这些非臭虫蠓体形细微、无法传染，但6.39万平方公里西溪屈艾的巨大数目严重影响了游人的生活与游憩，在我看来一只蠓是传染人类最轻的奇虫，那么蜂虎蠓甚至更为数可以构成contrary（Kettle，1962)，以致于每年时不时有游人对西溪蠓类的危害性进行举报。

为及时处理介绍西溪臭虫蠓或非臭虫蠓群落组成结构，及时处理掌控蠓类危害性静态，探明储量西溪蠓类主要就竞争优势种，透过细胞核黑色素C合酶核糖体I(cytochrome oxidase subunit I，COI）和rDNA内mRNA间距区（internal transcribed spacer 1，ITS-1）DNA，更进一步介绍本沿海地区主要就蠓种遗传基因差别（Mathieu等，2007；Morag等，2012；Harrup等，2016)，以期更进一步介绍其与国际DNA文库相关亚种形态学关系，全面介绍其在西溪整个生态系中的作用。

1材料与方法

1.1样品采集

主要就采用光诱捕法（功夫小帅，武汉吉星科技有限公司），2017-2018年5-11月期间，选取杭州西溪风景名胜区9个具有典型生境的景点：湖滨管理处、钱王祠、三潭印月、湖心亭、郭庄、曲院风荷、灵隐寺、灵隐中队、植物园等作为监测点，每个监测点放置2盏诱捕器。诱捕器距的高度约为2 m，每月上中旬诱集一次，每次诱集时间为24小时（当日9:00～翌日9:00)。

翌日将收集到的样本用乙醚麻醉后，经初步形态观察分离后，用眼科镊子轻轻地将收集袋中的成虫装入75%酒精的0.25 ml离心管中，放入－4℃冰箱保存备用。

1.2蠓种形态学鉴定

主要就采用标片法，参照虞以新（2006b)、Borkent和Spinelli(2007)，依次透过“割翅－腐蚀（5%氢氧化钠－漂洗－脱水（系列梯度酒精－封片（加拿大树胶：二甲苯=2:1)”等流程，最后将制作完成的标本置放于阴凉处或45℃-50℃烘箱中进行干燥。所用仪器设备为SmartZoom 5体视显微镜和AX10 Imager A1生物显微镜（Zeiss，德国）。

1.3竞争优势种指数确定

根据制片与分类镜检结果，分别统计分析捕获率（R)、月传染率（M）和竞争优势种指数（d）等主要就参数，探明储量西溪风景名胜区究竟存在哪些蠓类、竞争优势地位及其种间竞争能力。

1.4 DNA提取

选取西溪主要就竞争优势种，首先将5只雌虫（XH01-5拜氏铗蠓Forcipomyia bikanni，2017年8月和10月均采自于植物园）置于液氮中，充分研磨后，然后按照Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega，北京）试剂盒操作说明，提取DNA，-20℃冷冻保存备用。

1.5PCR扩增

参照Morag等（2012)，主要就检测蠓类COI(600 bp）和ITS-1 (400 bp）两大DNA，所用引物依次为COI: C1-J-1718m 5‘-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGT-3’和C1-N-2191m 5-CAGGTAAAATTAAAATATAAACTTCTGG-3；ITS-1: PanCulF 5-GTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3 和 PanCulR 5-TGCGGTCTTCATCGAACCCAT-3 。PCR扩增主要就选用Green Taq Mix试剂盒（Vazyme，南京），反应体系包括2 µL DNA、1 µL 10 µM上游引物或下游引物和12.5 µL Green Taq Mix混合液，共25µl。

将配制好的反应液置于S1000^TMPCR仪（Bio-Rad，美国）中：94℃预变性5 min；94℃变性1 min、53℃退火30 sec、72℃延伸30 sec ，共30个循环；72℃延伸10 min。再将DNA扩增后的PCR产物置于1.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳（100 V,25 min)，然后将胶条置于Bio-Rad Gel Doc^TMEZ System凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）进行观察。

1.6序列分析

将扩增后的PCR产物经擎科（杭州）生物科技有限公司纯化与测序后，获得所需的DNA序列。然后打开MEGA 10.1.7(Kumar等，2018；Hall，2018)，从主窗口“Align”菜单选择“Do BLAST Search”，利用MEGA中的网页浏览器自动连接到美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，）)进行BLAST核酸序列比对，在“Query sequence”输入测序序列，选择“blastn”查找亲缘关系较远的序列。在Algorithm parameters中挑选E（(Expect threshold≤10^-）)并且与查询序列长度约有90%重叠的序列，然后透过MEGA主菜单中的“Models”，选择“寻找最好的DNA/蛋白质ML模型”建立系统发生树，探索西溪主要就蠓类相关DNA序列地理溯源。为了估计可靠性，在“分析参数设置”窗口，选择“自展法Bootstrap”计算1000次重复。

2结  果

2.1蠓种组成结构

经镜检观察与制片分析，2017-2018年期间捕获到的西溪蠓类共分蠓总科、毛蠓总科、铗蠓总科3总科，约7属12种，其中蠓总科包括4属：库蠓属、须蠓属、贝蠓属、柱蠓属；铗蠓总科有铗蠓属和裸蠓属2属；毛蠓总科仅毛蠓属，其中臭虫蠓类只有库蠓属中的北京库蠓和秀茎库蠓2种（表1)。

表1.西溪名胜风景区主要就蠓种名录

该沿海地区主要就竞争优势种为非臭虫蠓——拜氏铗蠓，其数目约占整个捕获蠓类总量的52.3%，居于绝对的竞争优势地位。其次为毛蠓属Dasyheleasp.1^#和Dasyheleasp.2^#所占比例为13-15%；再次为裸蠓属Binipenissp.约占总数的6.5%。而臭虫蠓仅为北京库蠓和秀茎库蠓2种，前者所占比例为3.7%，后者不足1%，在中间竞争中处于劣势地位，且月传染率（MBR）不足5%，每小时每盏灯捕获的数目也不足1只（R=0.04)，致使总体危害性水平较轻，远远低于理论的（图1)。

2.2 蠓种静态变化规律

拜氏铗蠓在9个监测点中均有分布，为广布种，其中捕获数目最多的是曲苑风荷；其次为毛蠓属和裸蠓属，也是各个监测点主要就种类之一。而秀茎库蠓、弯胫须蠓、万源贝蠓则分布较为狭窄，仅在2-3个监测点存在。虽然从捕获数目来看，曲苑风荷蠓类数目最多，但从蠓种多样性来看，无疑是植物园，这与植物园优美的环境、丰富的植被、适宜的土壤等分不开。三潭印月由于独处孤岛，亚种特别单一，仅3种。而湖心亭虽然也是湖中孤岛、人迹罕至，但蠓种却多达6种。说明不同生态类型，蠓种的分布也不尽相同，生态环境的好坏也决定了蠓种的多样性。

根据季节性消长趋势，西溪蠓类危害性呈典型的双峰型，8月和10月是其活动高峰，这一点与拜氏铗蠓活动规律完全一致（图2)，5-8月随着气温的逐渐升高而活动频繁，但至11月后随着气温的更进一步降低，蠓类的危害性逐渐减弱，但少数监测点仍然可见蠓类活动。裸蠓属、须蠓属、贝蠓属、柱蠓属仅限于8月份以前，附突铗蠓仅在9-11月活动，而拜氏铗蠓、北京库蠓和毛蠓属绝多半数种类，常年基本上都有活动。

2.3 DNA测序与序列分析

经凝胶成像检测与DNA公司测序后，所得XHO1-5拜氏铗蠓COIDNA大小为523 bp；ITS-1为315 bp。

2.3.1 COIDNA序列分析

透过NCBI数据库中的BLASTN序列检索，选择GenBank中相似度≥86%和E期望值低于0.1%以下的65个具有代表性的序列进行比对，包括3种铗蠓属与4种库蠓属，如：Ceratopogonidaesp.(HQ979089、KC502145)；尖喙库蠓（JN545045、JN545047)；薛采库蠓 (Cu. schultzei，MF399699)；索诺拉库蠓（Cu. sonorensis，KT794144、 KY707833、LN484060)；Cu. variipennis(KT794138)；Fo. bipunctata(HQ981469、JF867837、KJ768005、KR649517、KT099530、MG171510）等。

首先透过MEGA主菜单中的“Models”，选择“寻找最好的DNA/蛋白质ML模型”，根据赤池信息准则（Akaike Information Criterion，AICc)、对数似然值（log likelihood，InL）和贝叶斯信息准则（Bayesian information criterion，BIC)3种不同适合度检验结果，从最大似然法24种不同组合中选择总时间可逆模型（GTR）来构建最能准确代表序列的分支历史演化次序的系统树（图3)。结果发现上述DNA序列均来自同一祖先，Fo. bikanni(XH01-5）虽然与编号LC015045来自福建的拜氏铗蠓COIDNA序列高度相似（97.9%，图3)，但两者分支界线较为明显（截止值95%)。

2.3.2 ITS-1DNA序列分析

同样方法。对于ITS-1DNA，选择GenBank相似度高于92%、E期望值低于0.1%的43个具有代表性的序列进行比对：琉球库蠓 (Cu. actoni，AB462259、MK892990、MK892991、MK892992)；Cu. alachua(MK892993)；短跗库蠓（Cu. brevitarsis,MK893000)；环斑库蠓（KJ818243)；Cu. fulvus(MK893006、MK893007)；Cu. grahamii(MK893008、MK893009)；Cu. loxodontis(MK893022)；婚飞库蠓 (Cu. maritimus，AJ417981)；Cu. obscurus(MK893029、MK893030、MK893031)；不显库蠓（Cu. obsoletus，MK893032、MK893033、MK893034、MK893035)；冲绳库蠓（KY552922)；尖喙库蠓（JN408476)；帕罗库蠓（Cu. parroti，KF178260)；Cu. pseudopallidipennis(MK893038)；Cu. punctatus(AY861157)；Cu. sanguisuga(MK893042、MK893043)；薛采库蠓（Cu. schultzei，JN408474、JN408475、JN408477)；苏格兰库蠓（Cu. scoticus，MK893044、MK893045)；兴安库蠓（Cu. sinanoensis，MK893047)；Culicoidessp. (KY620882)；Cu. tuttifrutti(MK893050)；累赘库蠓（Cu. verbosus，AB462281)；Fo. peregrinator(HM775508、HM775509)；Forcipomyiasp. (HM775506)；Fo. townsvillensis(HM775502、 HM775503、HM775504、HM775505)。

仍然选择最大似然法中的GTR进行构建无根树，虽然上述45个DNA均来自同一祖先。拜氏铗蠓XH01-5与环斑库蠓（KJ818243)、冲绳库蠓（KY552922）和Fo. townsvillensis(HM775502、HM775503、HM775504）同源性高达98%，但属于不同的进化分支，但仅与尖喙库蠓（JN408476）处于同一分支（图4)。

3讨  论

从鸟类地理区划来看，浙江属于东洋界。从气候上来说是温带和温带，铗蠓属在全世界广为分布。从习性来看，拜氏铗蠓较为喜欢温暖湿润环境，西溪得天独厚的环境也非常有利于其生存，许多堤岸、石窟、洞穴、泥沼地、半湿地、滩涂、树洞、苔藓、藻类、腐烂的木头或植物茎，给蠓虫的交配产卵、繁育后代、迁飞扩散等提供了理想的栖息和繁衍场所，尤其是真正的严冬季节比较短暂。但国际上，拜氏铗蠓仅在新加坡有分布，国内也仅河南、福建、广东、广西、四川等（虞以新等，2006；Borkent，2020)，分布区较为狭窄。

根据COIDNA序列分析结果，浙江拜氏铗蠓与编号LC015045的邻近省份福建拜氏铗蠓DNA序列，虽然在形态学树上处于不同的分支，但从地源上看浙江与福建在温度、湿度、植被、生境等方面存在一定的重叠性。

从检测结果看，无论是COI还是ITS-1DNA序列分析，拜氏铗蠓XH01-5均与来自以色列的尖喙库蠓（JN408476；Morag等，2012）处于同一分支，充分说明本研究透过最大似然法和GTR模型构建的无根形态学树是非常成功的。从侧面也充分说明了，COI与ITS-1DNA不仅有助于介绍该亚种的地理溯源性，在协助形态鉴定方面具有一定的参考价值（Mathieu等，2007；Morag等，2012；Harrup等，2016；Hakima等，2020)。

本研究中的DNA序列也将实时上传至Barcode of Life Data System (BOLD）和NCBI GenBank核酸数据库。

金虹¹，张海珍²，杨天赐³

1杭州卫康有害生物防治有限公司，浙江 杭州 310020；

2杭州植物园，浙江 杭州 310000；

3杭州国际旅行卫生保健中心（杭州海关口岸门诊部），浙江 杭州 310012

参 考 文 献

1.虞以新. 中国蠓虫类（鼠类纲，双翅目） 第一卷[M]. 北京： 军事医学科学出版社， 2006a.

2.虞以新. 中国蠓虫类（鼠类纲，双翅目） 第二卷[M]. 北京： 军事医学科学出版社， 2006b.

3.Hall, B.G.著. 陈士超， 吴晓运译（2018). 轻松构建形态学树实用操作方法和理论 （第4版）. 北京： 高等教育出版社.

4.Borkent, A. & Dominiak, P. (2020). Catalog of the biting midges of the world (Diptera: Ceratopogonidae).Zootaxa, 4787(1): 1-377.

5.Borkent, A. & Spinelli, G.R. (2007) Aquatic biodiversity in Latin America—Volume 4--Neotropical Ceratopogonidae (Diptera: Insecta). Bulgaria: Sofia-Moscow: Pensoft, 34-128.

6.Hakima, B. Hwang, H.-S. Lee, K.Y. (2020) Molecular identification ofCulicoides(Diptera: Ceratopogonidae) species in Algeria.Acta Tropica, 202: 105261.https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2019.105261. [accessed on 1 June 2019].

7.Harrup, L.E. Laban, S. Purse, B.V. Reddy, Y.K. Reddy, Y.N. et al. (2016) DNA barcoding and surveillance sampling strategies forCulicoidesbiting midges (Diptera: Ceratopogonidae) in southern India.Parasites & Vectors, 9:461.DOI 10.1186/s13071-016-1722-z. [accessed on 1 June 2019].

8.Kettle, D.S. (1962) The bionomics and control ofCulicoidesandLeptoconops(Diptera, Ceratopogonidae = Heleidae).Annual Review of Entomology, 401-418.

9.Kumar, S. Stecher, G. Li, M. Knyaz, C. & Tamura, K. (2018) MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms.Molecular Biology and Evolution, 35: 1547-1549.

10.Mathieu, B. Perrin, A. Baldet, T. Delécolle, J.-C. Albina, E. & Cêtre-Sossah, C. (2007) Molecular identification of western European species ofObsoletuscomplex (Diptera: Ceratopogonidae) by an internal transcribed spacer-1 rDNA multiplex polymerase chain reaction assay.Journal of Medical Entomology, 44(6): 1019-1025.

11.Mellor, P.S. Boorman, J. & Baylis, M.(2000)Culicoidesbiting midges: their role as arbovirus vectors.Annual Review of Entomology, 45: 307-340.

12.Morag, N. Saroya, Y. Braverman, Y. Klement, E. Gottlieb, Y. (2012) Molecular identification, phylogenetic status, and geographic distribution ofCulicoides oxystoma(Diptera: Ceratopogonidae) in Israel. PLoS ONE, 7(3): e33610. doi:10.1371/journal.pone.0033610. [accessed on 1 June 2019].

13.Mullen, G.R. & Murphree, C.S. (2019) Biting midges (Ceratopogonidae). Medical and veterinary entomology, 3rd edn (ed. by G.R. Mullen & L.A. Durden). Academic Press, London, pp. 213-236.